Контрактное производство

9. Микробиологический контроль.

Микробиологическое качество продукта обуславливается тем, что в нём не содержится:

- патогенных бактерий;

- токсинов, выделяемых микроорганизмами;

- запрещенных консервантов.

Косметические продукты не должны быть загрязнены микроорганизма­ми, потенциально способными навредить здоровью потребителей, изменить свойства продукта или сделать продукт непривлекательным для потребите­лей и уменьшить спрос на него.

Согласно закону, лицо или компания, размещающие косметический про­дукт на рынке, полностью отвечают за безопасность продукта и обязуются осу­ществлять своевременные и эффективные санитарно-гигиенические меры. В то же время в законе не обозначено, какие именно методы микробиологиче­ского контроля должны применяться.

Согласно Статье 5.4 TP ТС «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» в Российской Федерации с 01.07.2012 определены требования к микробиологическим показателям парфюмерно-косметической продукции:

4.1. Микробиологические показатели парфюмерно-косметиче-
ской продукции должны соответствовать требованиям, содержа-
щимся в приложении 7.

4.2. Не определяются микробиологические показатели для следующих видов парфюмерно-косметической продукции:

1) парфюмерно-косметическая продукция, содержащая этиловый спирт и/или органические растворители в концентрации более 25 % по объему, используемая без разведения;

2) лаки для ногтей, кроме лаков для ногтей на водной основе;

3) дезодоранты, дезодоранты - антиперспиранты, антиперспиранты;

4) окислительные краски для волос, средства для осветления и мелирова­ния;

5) средства для химической завивки и средства для выпрямления волос на основе тиоловых соединений;

6) средства для депиляции на основе тиогликолевой кислоты;

7) туалетное мыло твердое на жировой основе;

8)сухие карандаши;

9) соли для ванн;

10) 100 %-ные эфирные масла;

11) средства для отбеливания зубов, содержащие перекись водорода или другие компоненты, выделяющие перекись водорода, включая перекись кар­бамида и перекись цинка, с концентрацией перекиси водорода (в качестве ингредиента или выделяемой) 0,1% - 6,0%;

12) средства для бритья (кремы, гели и др.), имеющие водородный показа­тель рН более 10,0.

В Российской федерации на настоящий момент (сентябрь 2012 год) еще не утверждены нормативные документы и методические указания, которые будут регламентировать санитарные микробиологический контроль на про­изводстве парфюмерии и косметики в соответствии с требованиями Техниче­ских регламентов Таможенного союза. Перечень национальных нормативных документов приведен ниже.

1) МУ 42-51-15-93 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. КОНТРОЛЬ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ОДЕЖДЫ

2) МУ 42-51-14-93 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. КОНТРОЛЬ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ РУК ПЕРСОНАЛА

3) «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды центра­лизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. СанПиН 2.1.4.1074-01»

4) МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.734-99. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СРЕДЫ 

В этой главе описываются современные методы осуществления микро­биологического контроля при производстве косметической продукции в ЕС. Однако следует помнить, что эти методы и процедуры носят рекомендатель­ный характер с точки зрения законодательства ЕС.

9.1. Отбор проб.

Отбором проб должны заниматься сотрудники, обладающие соответству­ющей квалификацией. Область занятости при этом роли не играет: отбором проб могут заниматься сотрудники отдела контроля качества (обеспечение качества, микробиология), производственного отдела или даже складского отдела.

Пробы отбирают в стерильные флаконы с помощью стерильных инстру­ментов для отбора. Для стерилизации пригодны несколько способов, но пред­почтение нужно отдавать сухой стерилизации (не менее 2 часов при 180°С) или стерилизации при высоком давлении (не менее 10 мин при 134°С или не менее 20 мин при 12ГС).

Для очистки аппаратуры от загрязнения её часто промывают спиртом или помещают в емкости со спиртом. Однако важно помнить, что обработка спир­том (концентрация этанола или изопропанола должна быть не менее 60%) подходит только для экстренной стерилизации и не гарантирует полное унич­тожение всех спор бактерий.

Пробы следует, по мере возможности, отбирать в обстановке, сводящей к минимуму риск контаминации. В особенности это важно тогда, когда пробы отбираются из емкостей, которые рассчитаны на многократное открывание и многократный отбор содержимого (например, при отборе проб из контейне­ров или цистерн, в которых хранится сырьё или готовая продукция, или при отборе упаковочных единиц из коробок). Для создания обстановки с мини­мальной вероятностью контаминации рекомендуется ограничить сквозной проход через рабочее помещение, регулярно очищать и дезинфицировать его. Не стоит отбирать пробы вне помещений, на открытом воздухе. Если же при отборе проб никак нельзя добиться требуемых санитарно-гигиенических условий, отбор нужно проводить в специальных вытяжных шкафах с ламинар­ным потоком воздуха.

До начала отбора проб каждый флакон необходимо маркировать этикет­кой (обычно водостойкой) с указанием:

- наименования продукта;

- номера партии (в случае, если в одной партии было несколько контейне­ров, следует также обозначить номер контейнера)

- даты производства.

После отбора пробы сотрудник, отбиравший её, должен обозначить на флаконе свою подпись и дату отбора пробы.

Если система контроля качества предприятия включает в себя систему электронной обработки данных, флаконы с пробами необходимо маркиро­вать этикеткой, содержащей штриховой код. При таком способе маркирова­ния реже происходят ошибки при нанесении этикетки, и намного легче соот­носить аналитические результаты проверки с конкретными пробами.

Процесс отбора проб должен быть четко описан в нормативно-техниче­ской документации на каждый вид продукции. Это относится и к упаковоч­ным материалам, и к сырью, и к готовой продукции. Перед началом работы на производстве следует обучать всех сотрудников стандартным операционным процедурам и стандартным методам проведения анализов.

Нужно создать график отбора проб. Для этого необходимо провести ана­лиз рисков, связанных с сырьём, упаковочными материалами, нефасованной и готовой продукцией. В Табл. 1 указаны параметры, на которые необходимо обратить особое внимание при анализе рисков.

В графике отбора проб должны быть обозначены лица, ответственные за отбор проб, проведение анализов и обработку полученных результатов.

Должны быть приведены ссылки на соответствующие правила и нормы. В этом же графике должны быть приведены все требования к частоте отбора и объ­ёму проб, а также к условиям хранения вплоть до проведения анализа. Кроме того, должны быть указаны методы анализа (при необходимости должны быть приведены ссылки на государственные стандарты метода).

Частота отбора проб во многом определяется восприимчивостью матери­ала к контаминации. При определении частоты отбора проб и необходимого объёма пробы следует принять в расчет параметры, указанные в Табл. 1.

Влажность продуктов (активность воды) - один из важнейших критериев, определяющих восприимчивость сырья, нефасованной и готовой продукции к микробиологической контаминации.

Активность воды в составе продукта - это отношение давления паров воды над данным продуктом к давлению паров над чистой водой при одной и той же температуре. Давление паров воды над продуктом нельзя рассчитать, непосредственно исходя из процентного содержания воды в составе продук­та. Давление паров зависит от содержания компонентов, связывающих воду. Следовательно, у мыла с достаточно низким содержанием воды, хранящего­ся во влажном помещении, величина активности воды может составить 0,95 более. Сырье, содержащее большое количество компонентов, связывающих воду (высокомолекулярные спирты, ПАВ и т.д.), обычно не подвержено микро­биологической контаминации. В таких условиях могут размножаться только высокоспециализированные штаммы микроорганизмов.

Если опыт работы с определённым типом сырья говорит о его восприим­чивости к микробиологической контаминации, следует отбирать пробы из каждой партии такого сырья. Точное число отбираемых проб нужно опреде­лять с учетом особенностей, свойственных данной конкретной компании. Из разовых проб составляют смешанные пробы, которые позволяют сократить количество анализов и связанных с ними лабораторных работ. Если сырьё ме­нее восприимчиво к микробиологической контаминации, имеет смысл

отби­рать пробы не из всех партий сразу, а, например, из каждой пятой или десятой («выборочный контроль с пропуском партий»).

В таблице 4 приведены результаты систематического микробиологическо­го исследования, проведенного с использованием некоторых типов космети­ческого сырья. Эти результаты могут пригодиться при классификации сырья и готовой продукции - прежде всего, компаниям с небольшими базами данных. Благодаря этой таблице становится понятно микробиологическое значение воды: она крайне восприимчива к контаминации, и при этом является одним из основных ингредиентов, используемых в составе косметических средств, если измерять по объёму. Почти в 30% из 757 проб воды, отобранных для ана­лиза на стерильность, количество микроорганизмов было выше стандартно­го микробиологического минимума (общее количество бактерий < 100 КОЕ на мл, и в 1 мл анализируемого состава нет бактерий вида Enterobacteria и Pseudomonas).

Необходимы четкие методические указания, описывающие работу с про­бами после того, как они были взяты (условия хранения, максимальное время хранения до проведения анализа), и подготовку проб к анализу (например, гомогенизацию, фильтрацию, разведение, устранение антимикробного дей­ствия входящих в состав продукта консервантов).

Кроме того, необходимо указать, могут ли пробы храниться для дальней­ших анализов, и если могут, то при каких условиях (указать срок хранения).

9.2. Производственные проверки (сырьё-упаковка-емкости для смешивания-хранение-наполнение-фасовка)

9.2.1. Сырьё.

Все типы сырья, в том числе важнейший ингредиент косметических средств - воду, необходимо классифицировать по степени восприимчивости к контаминации. Далее необходимо проводить отбор и анализ проб в соответ­ствии с графиком отбора проб.

Если сырьё поступает на завод в емкости для перевозки, следует, по воз­можности, отбирать пробы непосредственно после поступления, перед тем, как сырьё переместят в контейнеры для хранения. Благодаря этому будет про­ще выявить источник контаминации.

Первичная упаковка обычно не представляет опасности для микробиоло­гического качества готовых изделий, если она хранится в надлежащих услови­ях. Однако состояние первичной упаковки сильно зависит от вторичной упа­ковки (например, полимерной плёнки), защищающей её от пыли. Кроме того, микробиологическое состояние первичной упаковки зависит от соблюдения всех необходимых санитарно-гигиенических мер при её транспортировке и хранении. Обязательно нужно определять микробиологическую чистоту пер­вичной упаковки, если есть подозрение, что она могла запылиться, загряз­ниться или покрыться влагой, так как при таких условиях риск контаминации возрастает.

Помещение продуктов на карантин связано с целым рядом трудностей (проведение полного набора микробиологических тестов занимает, по край­ней мере, 3-5 дней, и все это время продукты находятся на карантине). Для того чтобы облегчить ситуацию, рекомендуется выбирать поставщиков таким образом, чтобы им можно было доверять, и постоянно поддерживать связь с производителями сырья и упаковочных материалов. Такие отношения, осно­ванные на доверии, позволят сократить число необходимых микробиологи­ческих проверок.

Очень важно запрашивать у поставщика не только сертификаты качества продукции (DIN ISO, GMP и т.д.), но и внутренние результаты определения микробиологической чистоты. В отчетах о проверке должны быть указаны не только общие заключения о санитарно-гигиеническом состоянии продукта, но и используемые методы оценки микробиологической частоты, график от­бора и анализа проб, ход выполнения и результаты анализов, а также вся со­путствующая документация.

9.2.2. Нефасованная продукция.

Пробы нефасованной продукции обычно отбираются прямо из емкости для смешивания продукта или из контейнера для промежуточного хранения, т.е. до розлива.

Анализ микробиологической чистоты нефасованной продукции прово­дится довольно редко, так как во время анализа продукты должны находить­ся на карантине в течение 3-5 дней, и за это время неоправданно возрастает риск контаминации. При анализе нефасованной продукции обычно ограничи­ваются определением физико-химических показателей. В частности, следует определять концентрацию консервантов. Рекомендуется хранить пробы не­фасованной продукции на тот случай, если в готовой продукции будет обна­ружено микробиологическое загрязнение. В такой ситуации пробы помогут ретроспективно установить источник контаминации.

Нужно ли отбирать и анализировать пробы каждой партии нефасованной продукции, или можно осуществлять выборочный контроль с определенным интервалом отбора проб? Это решение должен принимать квалифицирован­ный эксперт. Для уменьшения риска контаминации следует как можно чаще проводить контроль микробиологической чистоты нефасованной продукции, склонной к контаминации, а также любой продукции, с которой у данной ком­пании ещё нет опыта обращения.

Пробы можно отбирать непосредственбно из чанов для смешения, из ем­костей для промежуточного хранения, или из систем подачи в момент накач­ки в емкости для промежуточного хранения. Место отбора пробы в каждом случае выбирается индивидуально. Если пробы отбираются во время накач­ки, можно отобрать несколько проб из разных участков системы и тем самым облегчить поиск возможного источника контаминации. Откуда бы ни отбира­лась проба, следует четко вписать отбор проб в производственный процесс.

Пробы нефасованной продукции лучше не отбирать во время промежу­точного хранения, так как открывание-закрывание контейнеров для про­межуточного хранения увеличивает риск контаминации продукта. Однако в ряде ситуаций отбор проб необходим (при поиске источника контаминации, для подтверждения факта контаминации нефасованной партии продукта, при сомнении в адекватности работы системы консервантов, и т.д.). К примеру, от­бор проб необходим, когда возникло подозрение, что контаминацию вызвали плохо вымытые контейнеры для хранения.

9.2.3. Готовая продукция.

Пробы готовой продукции, предназначенные для анализа на микробиоло­гическую чистоту, нужно отбирать в процессе затаривания, согласно состав­ленному графику. При отборе проб нужно подстраиваться под разнообраз­ные экстренные ситуации. Например, во время простоя на производстве (при пересмене, ремонте или затаривании другой партии нефасованной продук­ции) продукция тоже простаивает, и это нужно учесть при отборе проб.

9.2.4. Дополнительные анализы.

При обнаружении роста микроорганизмов рекомендуется провести до­полнительную проверку уже обработанных образцов (повторный анализ) или отобрать новые образцы для анализа из той же партии (перекрёстная провер­ка). Эти меры позволят подтвердить или опровергнуть полученный результат.

Для того чтобы получить представление о масштабе контаминации и об её вероятном источнике, рекомендуется отобрать для анализа пробы из той же партии. Например, стоит брать пробы сырья или нефасованной продукции из той же партии, но из других контейнеров, или пробы готовой продукции из той же партии, но взятые из других чанов для смешения или из порции продукта, расфасованной в другое время. Для определения масштаба контаминации ре­комендуется проанализировать пробы, взятые из партий, обработанных до и после той партии, в которой была выявлена контаминация.

При обработке результатов дополнительных анализов следует помнить, что положительный результат можно считать ошибочным только в том слу­чае, если твердо доказана его ошибочность (например, если контаминация в процессе отбора пробы привела к ошибке, или если для анализа были ис­пользованы загрязненные бактериями среды или растворы). Отрицательные результаты при повторной проверке могут быть получены из-за того, что за­грязнение партии было негомогенным, или из-за того, что с течением време­ни консерванты успели подействовать на микроорганизмы и уменьшить их число.

При апробации продукта необходимо тщательно проанализировать ре­зультаты всех проверок микробиологической чистоты и, в некоторых случаях, учесть результаты мониторинга концентрации консервантов.

Если в ходе первичных анализов был выявлен рост определенных коло­ний, апробация продукта может произойти только тогда, когда будет доказа­но, что рост бактерий был получен из-за ошибки в ходе анализа.

В перечне стандартных рабочих процедур должен быть четко прописан порядок действий, которые необходимо осуществить при выявлении роста микроорганизмов. В случае, когда рекомендуется проводить дополнительный анализ большого числа разовых проб, в перечне стандартных рабочих проце­дур должно быть указано нужное количество дополнительных проб.

9.2.5. Микробиологические показатели безопасности.

Микробиологические показатели безопасности парфюмерно-косметической продукции в соответствии с требованиями Приложения 8 рекомендаций (SCCNFP (SCCNRP/0690/03 Final, 20 октября 2003 г.)

Косметические продукты для детей до 3 лет. Косметические продукты для глаз и слизистых оболочек.	Остальные продукты
Общее количество мезофильных, аэробных микроорганизмов	Общее количество мезофильных, аэробных микроорганизмов
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans отсутствуют в 0,5 г или мл продукции	Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeru­ginosa и Candida albicans отсутствуют в 0,1 г или мл продукции

9.2.5.1. Готовая косметическая продукция.

Микробиологические нормативы для парфюмерно-косметической про­дукции были введены в добавочном приложении 7 к 7 поправке Директивы по косметике ЕС Научным комитетом по косметической продукции и непродо­вольственным товарам (SCCNFP).yKa3aHHbie нормативы следует считать мини­мальными требованиями. При оценке микробиологической чистоты парфю­мерно-косметической продукции производитель полностью ответственен за анализ ситуации и за оценку потенциальной угрозы здоровью потребителей. 

При оценке безопасности продукции производитель должен уделить вни­мание следующим параметрам:

-Тип бактерий (патогенные - не патогенные)

- Рост контаминации (увеличивается ли количество колоний бактерий и грибов в продукте)

- Возможна ли продукция токсинов (микотоксины, бактериальные токсины)

-Способ применения продукта (смываемый-несмываемый, попадает ли на слизистую оболочку или в зону вокруг глаз)

До сих пор не установлены микробиологические показатели безопасно­сти для токсинов, выделяемых микроорганизмами (например, афлатоксинов), и для вирусов. Существуют тест-системы для обнаружения афлатоксинов, и го­товая косметическая продукция время от времени проверяется на наличие этого типа токсинов, однако методов выявления множества других микоток-синов и бактериальных токсинов, а также для вирусов пока не существует.

9.2.5.2. Сырьё для косметической продукции.

Микробиологическая чистота готовой продукции непосредственно зави­сит от микробиологической чистоты используемого сырья. Именно поэтому рекомендуется установить микробиологические показатели чистоты не толь­ко для готовой продукции, но и для косметического сырья.

Максимально допустимое число бактерий в 1 мл технической воды обыч­но составляет 100 КОЕ. На самом же деле для производства косметики следу­ет использовать воду, содержание бактерий в которой во много раз меньше. Особенно внимательно нужно проверять воду на наличие некоторых видов бактерий, критичных для производства и вызывающих контаминацию - на­пример, бактерий семейства Enterobacteriaceae или рода Pseudomonas.

9.3. Методы анализа

(см. также главу 10 «Мониторинг гигиены»).

Согласно секции 5 параграфа 1 № 2 Директивы по косметике ЕС, произ­водитель обязан составлять пакет документации по безопасности каждого выпускаемого косметического изделия, в котором должны быть указаны все микробиологические параметры (количество бактерий) готовой продукции и использованных сырьевых материалов.

Для того чтобы идти в ногу с современными разработками, микробиоло­гический контроль качества рекомендуется проводить в соответствии с одо­бренными и опубликованными стандартными методами анализа (PharmEU, USP, рекомендации Cosmetic Europe и т.д.).

Нужно быть уверенным в эффективности используемого метода. Особое внимание при оценке эффективности метода следует уделить качеству устра­нения антимикробного действия консервантов, входящих в состав парфюмер­но-косметических средств. Недостаточное устранение антимикробной актив­ности консервантов зачастую приводит к получению ложноотрицательного результата. Это одна из самых распространённых ошибок при осуществлении микробиологического контроля качества.

Особенно внимательно нужно оценивать эффективность метода в том слу­чае, если этот метод редко используется, разработан внутри компании или ис­пользуется для экспресс-проверки.

9.3.1. Определение общего количества бактерий.

Для анализа могут использоваться как разовые пробы, так и средние про­бы (т.е. соединенные и смешанные разовые пробы), однако предпочтение от­даётся разовым пробам. При анализе средней пробы следует помнить, что объём разовых проб в её составе меньше, и неравномерность распределе­ния микроорганизмов может привести к ложноотрицательному результа­ту анализа.

Большинство рекомендаций советует отбирать для испытания аликвоты весом не менее 10 грамм . Пробу разбавляют буферным раствором или насы­щенной средой, содержащими соединения для подавления антимикробной активности консервантов (обычно делают разведение 1:10, т.е. к 10 граммам пробы добавляют 90 грамм буфера или среды). Для подавления активности консервантов обычно используют смесь 1-3% твина-80, 0,3% лецитина и 0,1% L-гистидина. Для полной гомогенизации смеси и эффективного высвобожде­ния микроорганизмов пробы можно растереть в ступке, поместить в гомоге­низатор или растереть с помощью стеклянных бус.

При необходимости можно делать последующие десятикратные разведе­ния анализируемой смеси (например, 1 мл (10 мл) первого разведения разво­дят в 9 мл (90 мл) буфера или среды). После каждого разведения смесь необ­ходимо тщательно перемешать до гомогенности (на качалке или на вихревой мешалке). Аликвоты разбавленных проб наносят на поверхность или вглубь твердых сред для культивирования методом глубинного посева или разливом на твердую среду (для этого образец разливается на поверхности агара).

Посевы инкубируют в течение нескольких дней и затем подсчитывают количество колоний. Хотя метод глубинного посева рекомендуется для про­ведения микробиологических исследований, у него есть свой недостаток: не­которые бактерии, особенно аэробные, попав под слой агара, из-за нехватки кислорода начинают расти медленнее или вовсе не дают роста колоний.

При посеве разливом на агаровую поверхность следует наносить не мень­ше 0,1 мл и не больше 0,5 мл разведенной аликвоты.

Испытания на стерильность готовой продукции и сырья, пригодных для фильтрации (например, чистые растительные экстракты, вода, ПАВ, шампуни, средства для ванн и т.д.), следует проводить методом мембранных фильтров.

Суть метода состоит в том, что образцы (неразбавленные или, при необхо­димости, разбавленные) фильтруют через стерильный фильтр 0,45 мкм (0,22 мкм для испытания воды на стерильность), после чего фильтр омывается рас­твором (водой или буфером, содержащим вещества для нейтрализации ак­тивности консервантов). Далее фильтры помещают на твердую питательную среду и инкубируют в течение нескольких дней для выявления роста колоний.

Для выращивания бактериальных культур рекомендуется использовать казеиново-соевый пептонный агар, а для культур дрожжей и плесени лучше подходит декстрозный агар Сабуро. Малопитательный агар R2A, рекомендо­ванный в Европейской фармакопее (11), лучше подходит для подсчета микро­организмов в воде, чем питательный казеиново-соевый пептонный агар. Бак­териальные посевы инкубируют при 30-35°С (при подсчете микроорганизмов в воде инкубацию лучше проводить при 20-25°С), посевы грибов инкубиру­ют при 20-25°С. Бактериальные посевы инкубируют в течение как минимум 2 дней, а посевы грибов - в течение 4 дней.

При осуществлении микробиологического контроля сырья, нефасованной продукции и готовой продукции важно установить уровень тревоги и уро­вень действия. К примеру, если установить в качестве уровня действия 50% от предельно допустимого количества микроорганизмов, это позволит своевре­менно усилить меры контроля, проверить соблюдение правил очистки и де­зинфекции, и выявить причины загрязнения. Таким образом, можно защитить готовую продукцию от серьёзной микробиологической контаминации.

9.3.2. Выявление и идентификация конкретных микроорганизмов.

В таблице 6 отмечено, что нормативы различных стран регулируют не только величину общего допустимого количество микроорганизмов, но и за­крепляют необходимость отсутствия конкретных видов микроорганизмов. Однако нормативы эти значительно разнятся между собой.

В указаниях Объединенного комитета Европейских ассоциаций по пар­фюмерно-косметическому производству (Cosmetic Europe) и Европейской научной комиссии по потребительским продуктам ((SCCNFP) четко обозначе­но, что в определенном объёме аликвот не должно присутствовать бактерий определенного вида (см. таблицу 6). Согласно указаниям (SCCNFP, для про­верки роста бактерий в косметических продуктах для детей и в косметических продуктах для глаз берутся аликвоты весом 0,5 г., тогда как для проверки про­чих косметических продуктов достаточно аликвоты весом 0,1 г.

Запрещенные виды бактерий разнятся от указания к указанию (таблица 6). В рекомендациях (SCCNFP от 1998 года в списке запрещенных бактерий указа­ны только Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, тогда как в рекомендациях COLIPA и Немецкой ассоциации парфюмерии, кос­метики и средств личной гигиены (IKW), принятых до 1998, указано, что в со­ставе продукции не должно быть и Escherichia coli. В рекомендациях PharmaEU

и FDA требования ещё строже: наряду с перечисленными выше ограничени­ями в составе косметической продукции не должно быть энтеробактерий (PharmaEU) и грамотрицательных бактерий (FDA).

Вне зависимости от типа рекомендаций, который выберет компания, сле­дует помнить, что список бактерий в каждой рекомендации приведен для примера. На самом деле перечень бактерий, присутствие которых в составе косметической продукции нежелательно, намного длиннее и растёт с каждым новым открытием в сфере исследования патогенных микроорганизмов. Од­нако каждому ясно, что невозможно проверить продукт на наличие всех воз­можных бактерий-патогенов сразу.

В то же время при обработке и оценке результатов микробиологического контроля необходимо удостовериться, что здоровью потребителей не угро­жают патогенные бактерии, не включенные в «чёрные списки». Такие формы контроля микробиологической чистоты требуют индивидуального подхода, и для принятия решения следует привлекать к работе квалифицированных спе­циалистов.

Согласно требованиям Cosmetic Europe и IKW, в 0,1 г продукта не должно быть выявлено наличия бактерий из «черного списка». Для этого анализируют 1 мл десятикратно разведенного продукта, поскольку предел обнаружения в рекомендованных методах исследования составляет < 10 КОЕ/г. В рекоменда­ции (SCCNFP от 1998 года масса исследуемых аликвот была впервые увеличе­на: бактерии из «чёрного списка» не должны присутствовать в 0,5 г продукта. При этом объём разбавленной аликвоты соответствующим образом вырос (5 мл десятикратно разбавленного продукта).

Для выявления конкретных видов микроорганизмов в составе нефасован­ной или готовой продукции используют метод культивирования обогащенной культуры. Для этого аликвоту исследуемой продукции (например, 0,5 г) пере­носят в 10-100 мл среды для культивирования (например, бактерии можно вы­ращивать на казеиново-соевом пептонном агаре, а грибы - на среде Сабуро). Если через 2-4 дня инкубации отмечается помутнение среды, аликвоты куль­тивируемой среды помещаются на плашки с агаром для выявления конкрет­ного источника контаминации.

Если в результате проверки на микробиологическую чистоту или в ходе получения обогащенной культуры выявлен рост микроорганизмов, необхо­димо определить, к какому виду принадлежат бактерии, вызвавшие контами­нацию. Для примерной ориентировки рекомендуется, прежде всего, провести окраску по Граму и определить набор характерных для культуры ферментов (выявить наличие оксидазной, каталазной и аминопептидазной активности). Кроме того, для идентификации вида микроорганизмов используются ме­тоды культивирования на селективных средах и различные биохимические анализы.

9.3.3. Определение собственной антимикробной активности парфюмерно-косметической продукции.

Для определения антимикробной активности консервантов в составе парфюмерно-косметической продукции обычно используют стандартные ме­тоды, принятые в фармацевтической индустрии и приведенные в Немецкой Фармакопее, Европейской Фармакопее или в Фармакопее США. Европейские и Американские ассоциации производителей косметики также предлагают перечни методов, рекомендуемых для нужд косметической промышленности. Все методы определения антимикробной активности консервантов базируют­ся на общем алгоритме:

1.Выращивание тест-штаммов микроорганизмов и получение суспензии
микроорганизмов

2.Внесение суспензии в аликвоту испытываемого средства

3.Инкубация аликвоты с суспензией микроорганизмов

4.Подсчет количества микроорганизмов в аликвоте после окончания времени инкубации.

Результаты анализа могут существенно меняться при изменении какого-либо из параметров.

В качестве тест-штаммов используют не только рекомендованные Европей­ской Фармакопеей штаммы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans и Aspergillus niger, но и штаммы Escherichia coli, рекомендо­ванные Фармакопеей США. При выборе тест-штаммов необходимо учитывать особенности, характерные для данного типа продукции и для производящей его компании. К примеру, следует дополнительно проверить антимикробную активность консервантов на тест-штаммах бактерий, которые часто обнару­живаются в производственных помещениях, а также на тест-штаммах тех бак­терий, критическая роль которых в контаминации была установлена эмпири­ческим путем.

При выращивании культур тест-штаммов необходимо четко соблюдать все заданные условия. При приготовлении суспензии микроорганизмов нужно получить смесь как можно большего числа колоний. Если в качестве тест-штаммов используются культуры микроорганизмов, выделенные из за­грязненных продуктов или обнаруженные в производственных помещениях, следует учесть, что в условиях лабораторного культивирования свойства этих культур могут быстро измениться. Поэтому использовать культуры, получен­ные таким образом, для проведения регулярных проверок достаточно бес­смысленно. Однако в ряде случаев использование таких «особых производ­ственных штаммов» позволяет облегчить борьбу с возникшей контаминацией (например, подыскать консерванты, способные защитить нестабильный про­дукт от контаминации).

Всегда нужно определять видовую принадлежность микроорганизмов, вызвавших контаминацию.

В аликвоту испытываемого средства можно вносить не только суспензию одного штамма бактерий, но и смесь нескольких штаммов (смешанную культу­ру). Следует учесть, что для получения смешанной культуры нужно соединять только суспензии бактерий, выросших на одинаковой питательной среде и в одинаковых условиях. Не следует смешивать больше трёх штаммов, так как это затруднит анализ результатов. Суспензии разных штаммов нужно смеши­вать непосредственно перед внесением суспензии в аликвоты исследуемой продукции. Все условия посева и выращивания культур (метод посева, выбор среды, время и температура инкубации) влияют на свойства колоний тест-штаммов. Именно поэтому рекомендуется четко задать все перечисленные параметры.

При выращивании тест-штаммов грибов следует помнить, что уровень спорообразования, от которого зависит общее количество спор в суспензии для внесения, зависит от выбора среды для культивирования и от времени инкубации. Взвесь микроорганизмов готовят, добавляя к культурам физио­логический раствор. Среда для культивирования не должна содержаться в суспензии: в её присутствии микроорганизмы размножаются быстрее, и эф­фективность работы консервантов снижается. Авторы книги полагают, что эта искусственная ситуация, благоприятная для роста бактерий, не подходит для проверки антимикробной активности консервантов, так как в процессе про­изводства косметическая продукция никогда не оказывается настолько за­грязненной органическими примесями.

Ещё один важный параметр - соотношение между объёмом проверяемой аликвоты и объёмом вносимой суспензии микроорганизмов. Обычно реко­мендуется вносить суспензию в объёме, составляющем 1% от объёма алик­воты. Если объём суспензии меньше, будет трудно равномерно перемешать микроорганизмы и распределить их по всему объёму пробы. Если объём су­спензии больше, избыток водного раствора может нарушить стабильность продукта (особенно продуктов в форме эмульсии типа «вода в масле»), и в та­ком случае эффективность консервантов уменьшится.

Смесь аликвоты и суспензии перемешивают, используя стеклянные бусы. Для перемешивания продуктов с пастообразной консистенцией и других вяз­ких смесей обычно используют вспомогательное оборудование, например, гомогенизаторы.

В быту контаминация чаще бывает локализованной (например, поверх­ностная контаминация крема в баночке), чем равномерной. Однако равно­мерное распределение микроорганизмов при определении антимикробной активности консервантов нужно не для имитации реальных форм контамина­ции, а для того, чтобы получить воспроизводимые результаты при подсчете бактерий. При анализе эффективности консервантов всегда используются одинаковые аликвоты продукта, и равномерность распределения бактерий в них также должна быть одинаковой.

Твердые продукты (мыла, помады и т.д.) невозможно равномерно смешать с суспензией. Для определения эффективности консервантов в составе таких продуктов используют альтернативный метод: на поверхность аликвоты про­дукта наносят суспензию микроорганизмов, инкубируют при определенной влажности, а по окончанию периода инкубации подсчитывают количество микроорганизмов на поверхности аликвоты.

Определение антимикробной активности консервантов в составе безво­дных средств (масел, пудр и т.д.) связано с целым рядом технических трудно­стей. Суспензия микроорганизмов - это водный раствор, а внесение водного раствора в безводный продукт сильно влияет на стабильность продукта. Тем самым результаты проверки эффективности консервантов будут искажены. Стабильность эмульсий также нарушается при добавлении к ним водной су­спензии бактерий. В литературе описано несколько способов, позволяющих вносить микроорганизмы в аликвоты безводных продуктов или продуктов в виде эмульсий. Можно использовать лиофилизированные культуры бактерий, можно вносить бактерии, сорбированные на вате или на мембранных филь­трах, можно непосредственно переносить бактерии с агара на исследуемые аликвоты. Однако ни один из перечисленных способов не нашел широкого применения на практике. Для того чтобы не нарушить стабильность эмульсий (особенно эмульсий типа «вода в масле»), объём вносимой суспензии умень­шают в 10 раз (1:1000 вместо 1:100). Выше уже упоминалось, каким образом уменьшение вносимого объёма суспензии может исказить результаты про­верки. Именно поэтому эффективность оценки антимикробной активности консервантов в составе безводных продуктов представляется не слишком высокой.

Сразу после внесения суспензии концентрация микроорганизмов в испы­тываемой аликвоте продукта должна составлять 105-106 КОЕ/мл или грамм продукта. Такая концентрация микроорганизмов считается завышенной по сравнению с той, что возникает в реальных условиях производства. Однако именно эта концентрация микроорганизмов необходима для того, чтобы оце­нить кинетические параметры антимикробного действия консервантов. Кро­ме того, эффективность консервантов следует испытывать в наихудших усло­виях из всех возможных.

Кроме обычной оценки эффективности консервантов, при проведении ко­торой суспензию микроорганизмов добавляют только один раз, существует и другой способ оценки, основанный на том, что суспензию микроорганизмов вносят в продукт многократно, через определенный промежуток времени (например, через неделю или через две недели). В фармакопеях Германии, Европы и США этот метод не обозначен как обязательный, но на практике он используется довольно часто.

Основное преимущество метода многократного внесения микроорганиз­мов состоит в том, что при обращении с некоторыми типами косметических продуктов (например, кремами в баночках) потребитель и в самом деле регу­лярно заносит в них бактерии. Этот метод проверки эффективности консер­вантов воссоздаёт чрезвычайно тяжелые условия. Об этом следует помнить, анализируя результаты испытания: не следует бездумно увеличивать концен­трацию консервантов при неблагоприятных результатах проверок.

Стандартное время проведения проверки эффективности консервантов составляет порядка 4 недель. Некоторые тестовые методики требуют больше­го времени проверки в связи с тем, что микроорганизмы склонны к адаптации. Именно поэтому консерванты, эффективно действующие первое время после добавления микроорганизмов, могут вызвать привыкание, и после периода затишья микроорганизмы снова начнут размножаться.

При определении общего количества микроорганизмов в косметической продукции необходимо устранить антимикробное действие консервантов, входящих в состав продукта. Эффективность устранения зависит от свойств используемых консервантов. Для ингибирования большинства стандартных систем консервантов обычно используют смесь 1-3% твина 80, 0,3% лецити­на, 0,1% L-гистидина и 0,1-0,5% тиосульфата натрия в буфере для разведения. Несколько лет назад производители питательных сред на основе агара нача­ли выпускать среды с добавками, инактивирующими консерванты. Эти среды стали всё чаще использоваться на практике. Такие среды позволяют понизить риск ложного отрицательного результата при бактериальном посеве, возни­кающий из-за недостаточного ингибирования консервантов.

9.3.4. Испытания в условиях эксплуатации.

Некоторые компании проводят дополнительную оценку эффективности консервантов - так называемые «испытания в условиях эксплуатации». Опре­деление собственной антимикробной активности парфюмерно-косметиче­ской продукции - методика in vitro, приводящаяся в лабораторных условиях, а испытания в условиях эксплуатации подразумевают проверку эффективно­сти консервантов в условиях, максимально приближенных к практике. Суть этих испытаний заключается в том, что определенному числу потребителей предоставляют образцы испытываемой продукции в оригинальной упаковке. Потребители используют эту продукцию по назначению в течение определен­ного времени.

По окончанию срока испытания проводят микробиологический анализ возвращенных образцов. По результатам проверки можно судить об устойчи­вости продукта к основным источникам микробиологической контаминации. Для того чтобы результаты исследования было легче интерпретировать, нуж­но тщательно и регулярно записывать все способы и условия использования продукта (регулярность и длительность использования, условия хранения у конечного потребителя, количество продукта, используемое при разовом на­несении, и т.д.).

Испытание в условиях эксплуатации позволяет проверить целый ряд па­раметров, которые не всегда удаётся проверить при стандартной лаборатор­ной оценке эффективности консервантов. В частности, испытание в условиях эксплуатации позволяет определить, насколько продукт восприимчив к дей­ствию бактерий, находящихся в помещении, в котором потребитель исполь­зует этот продукт. В ряде случаев эти бактерии оказываются гораздо более агрессивными, чем лабораторные штаммы. При всех своих преимуществах испытание в условиях эксплуатации - всего лишь дополнительный метод проверки стабильности консервантов. Из-за трудоемкости и невозможности контролировать параметры исследования этот метод никогда не сможет за­местить основной метод контроля - определение антимикробной активности консервантов.

9.4. Альтернативные методы.

Для определения общего количества микроорганизмов в составе сырья, нефасованной или готовой продукции существуют альтернативные методы.

В этом контексте стоит, в первую очередь, упомянуть измерение импе­данса и АТФ-биолюминесценцию - методы, за последние несколько лет при­обретшие популярность и заменяющие обычный метод культивирования на чашках.

Ниже приведен краткий обзор экспресс-методов оценки микробиологи­ческой чистоты продуктов.

1 . АТФ-биолюминесценция.

Данный количественный метод определения уровня контаминации в исследуемом материале основывается на определении присутствия АТФ (аденозин-5'-трифосфата). АТФ обнаруживается во всех живых клетках, будь то клетки животных, растений или микроорганизмов. Следует помнить, что метод АТФ-биолюминесценции не позволяет отличить АТФ, содержащийся в клетках растений или животных, от АТФ из клеток микроорганизмов. Метод основан на ферментной реакции: АТФ реагирует с системой субстрат/фермент (люциферин + люцифераза), и в результате этой реакции выделяется свет, ко­торый регистрируется с помощью люменометра. Свечение выражается в «от­носительных световых единицах» и коррелирует с количеством АТФ в образце.

АТФ-биолюминесценция уже много лет используется в качества удобной альтернативы обычному методу культивирования микроорганизмов при опре­делении общего числа микроорганизмов в жидких и твердых материалах. Для измерения редко используют неразбавленные и необработанные образцы жидких или твердых исследуемых продуктов. Во-первых, многие косметиче­ских продукты плохо совместимы с реагентами, необходимыми для проведе­ния реакции (отдушки, ПАВ, эмульгаторы и некоторые другие соединения вы­зывают гашение люминесценции). Во-вторых, метод АТФ-биолюминесценции недостаточно чувствителен для непосредственного анализа образцов про­дукции: допустимый уровень бактерий и грибов составляет порядка 10-1000 КОЕ/г или мл, а для однозначного обнаружения микроорганизмов с помощью АТФ-биолюминесценции в пробе должно быть 104-105 КОЕ/г или мл (23).

Для определения АТФ-биолюминесценции делают последовательные разведения образцов исследуемых продуктов, вносят их в подходящие сре­ды (например, мезофильные аэробные бактерии выращивают на казеиново-соевом пептонном агаре, а дрожжи и плесневые грибы - на среде Сабуро) и на их основе готовят обогащенные культуры. Для роста микроорганизмов культуры инкубируют в подходящих условиях. По окончанию необходимого периода инкубации (обычно не менее 24 часов) аликвоты обогащенных куль­тур обрабатывают экстракционным буфером, который растворяет клеточные стенки и высвобождает АТФ. Клеточные лизаты смешивают с реагентами для детектирования (люциферином и люциферазой), смесь помещают в кювету, и интенсивность свечения замеряют на люменометре (определяют количество относительных световых единиц).

Для увеличения количества бактерий в составе материалов, пригодных для фильтрации (например, воды, фильтрующегося сырья, очищающих и де­зинфицирующих средств), можно воспользоваться методом мембранных фильтров. Поверхность фильтра, с задержавшимися на ней клетками можно непосредственно обработать лизирующим буфером и определять АТФ в полу­ченном лизате.

Если количество бактерий слишком мало для определения АТФ, мембран­ный фильтр помещают на агар и инкубируют в течение нескольких часов. За это время количество микроорганизмов увеличивается. Было показано, что метод АТФ-биолюминесценции особенно подходит для контроля эффектив­ности очистки и дезинфекции на косметическом производстве, а именно для анализа воды, использовавшейся для промывки систем безразборной мойки.

Общее количество микроорганизмов определяют в самых разведенных пробах. Полученное значение относительных световых единиц сравнивают со стерильным контролем и определяют отношение двух показателей. Если в исследуемом препарате количество ОСЕ увеличено по крайней мере в 3 раза по сравнению с контролем, такое увеличение считают значимым.

При анализе результатов, полученных с помощью метода АТФ-биолюминесценции, следует обратить внимание на ряд аспектов:

Невозможно отличить АТФ из клеток микроорганизмов от АТФ из клеток животных или растений (особенно это затрудняет анализ продуктов животно­го или растительного происхождения).

Ферментная реакция, обеспечивающая свечение, нарушается в присут­ствии ряда соединений (солей, красок, ионов металлов, кислот, отдушек или остатков дезинфицирующих средств).

- Невозможно определить, какой тип микроорганизмов вызывает свечение.

2. Измерение импеданса.

Этот метод основан на измерении электрического сопротивления пита­тельной среды, в которой культивируются микроорганизмы. В ходе роста и метаболической активности микроорганизмы перерабатывают высокомоле­кулярные соединения. Образуются ионы, которые микроорганизмы секрети-руют в среду. В присутствии этих ионов проводимость среды увеличивается, а электрическое сопротивление уменьшается. С помощью этого метода можно различать разные виды микроорганизмов. Для этого нужно использовать се­лективные среды и условия культивирования, а также анализировать кривые импедансного сигнала.

3. Прямая эпифлуоресценция.

Этот метод подходит только для анализа жидких образцов, пригодных для фильтрации. Исследуемый материал фильтруют через мембрану, которую за­тем инкубируют в присутствии акридинового оранжевого красителя. Живые клетки приобретают оранжевую окраску, мертвые клетки - зелёную окраску. Учет клеток в окрашенном препарате можно осуществить с помощью микро­скопа. Этот метод обладает высокой чувствительностью, но требует огромных инвестиций и значительных затрат на персонал.

4. Лазерное сканирование клеток с флуоресцентными метками.

Как и в методе прямой эпифлуоресценции, исследуемый материал филь­труют через мембрану, которую затем инкубируют в присутствии реагента, на сей раз - красителя карбоксифлуоресцеин диацетата. Этот краситель прони­кает только в живые клетки, а содержащийся во всех живых клетках фермент эстераза расщепляет краситель и превращает его во флуоресцентное соеди­нение. Флуоресценция провоцируется действием лазера, и выделяемое пре­паратом свечение регистрируется с помощью лазерного сканера. Этот метод обладает высокой чувствительностью (возможно обнаружение одиночных клеток) и подходит для проведения экспресс-анализа. Однако, как и в случае эпифлуоресцентного анализа, этот метод требует значительных денежных затрат.

5. Проточная цитометрия.

Метод заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при про­хождении через него клетки в капиллярной трубке. Диаметр трубки таков, что возможен анализ отдельных клеток. Благодаря селективным методам окрашивания (флуоресцирующим антителам) можно определять присутствие конкретных видов микроорганизмов в препарате. Этот метод обладает высо­кой чувствительностью и позволяет отличать одни виды микроорганизмов от других, но требует значительных затрат денег и времени (т.к. жидкость по капиллярам идёт медленно). По этим причинам его используют только в лабо­раторных условиях.

6. Инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (Фурье-ИКС)
Этот метод базируется на выявлении характерного спектра ИК-излучения

бактерий. Так как спектр излучения содержит информацию обо всех клеточ­ных компонентах (протеинах, полисахаридах, жирных кислотах и т.д.), по спек­тру можно идентифицировать видовую принадлежность микроорганизма . Для идентификации культуры микроорганизмов снятый с неё ИК спектр срав­нивают с хранящимися в базе данных характерными ИК-спектрами, снятыми с чистых культур известных видов. Если чистая культура идентифицируемо­го микроорганизма уже получена, снять и идентифицировать спектр можно очень быстро и без особых затрат усилий. Приборы, позволяющие снимать ИК-спектры, стоят дорого, но их эксплуатация не затратна.

7. Иммунологический метод обнаружения

Этот метод позволяет определять присутствие микроорганизмов или их токсинов с помощью специфических антител. Один из самых распространён­ных иммунологических методов - твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). В сэндвич-модификации иммуноферментного анализа антитела, им­мобилизованные на поверхности плашки для анализа, специфически связы­вают бактерии. Далее в реакционную смесь добавляются вторичные специфи­ческие антитела к данному виду бактерий, связанные с красящим субстратом. Эти антитела тоже связываются с бактериями. После процедуры окрашивания комплексы микроорганизмов с антителами детектируются и подсчитываются. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа можно детектиро­вать и подсчитывать количество метаболитов микроорганизмов, например, токсинов.

Иммунофлуоресценция - модифицированный метод иммуноферментного анализа. Суть иммунофлуоресценции заключается в том, что специфические антитела красят флуоресцентным красителем, эти антитела связываются с микроорганизмами, иммобилизованными на стеклах, и окрашенный таким образом препарат можно анализировать с помощью микроскопа. Существу­ют и другие методы обнаружения микроорганизмов (ПЦР и идентификация с помощью меченных фрагментов ДНК), однако они не получили достаточного распространения в косметическом секторе.

9.5. Организация и оценка микробиологического контроля.

Микробиологический контроль - важная часть контроля качества и без­опасности продукции. Поэтому микробиологический контроль должен быть интегрирован в систему контроля качества (например, для выявления слабых мест в санитарно-гигиенической системе завода и для корректировки прини­маемых в этой связи мер) и должен производиться при проверке на соответ­ствие заданным стандартам (т.е. при апробации продукции).

Эффективность микробиологического контроля, в первую очередь, зави­сит от его правильной организации. Для этого:

• Микробиологический контроль доложен осуществляться на всех крити­ческих стадиях производства,

• Нужно использовать эффективные методы проверки,

• Проверки должны проводить квалифицированные сотрудники,

• Необходимо четко обозначить все предельно допустимые уровни, уровни тревоги и уровни действия;

• Необходимо проводить квалифицированный анализ полученных результатов.

Подобную систему контроля можно построить на базе концепции анализа рисков и критических контрольных точек (см. главу 10). Суть концепции со­стоит в том, что в общем течении производственного процесса выделяются критические параметры, и для проверки этих параметров проводятся кон­трольные мероприятия, анализы рисков и выявления пороговых значений. Для осуществления микробиологического контроля важно подобрать методы проверок, позволяющие быстро и качественно оценить ситуацию, и, при не­обходимости, принять эффективные контрмеры.